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Wiener klinisches Magazin
Erschienen in:

24.09.2021 | Pathologie

Next Generation Sequencing in der Pathologie

Anwendungen und methodische Herausforderungen

verfasst von: Univ.-Prof. Dr. Ulrich Lehmann, Prof. Dr. Andreas Jung

Erschienen in: Wiener klinisches Magazin | Ausgabe 6/2021

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Zusammenfassung

Die enorme Beschleunigung der DNA-Sequenzierung durch die Entwicklung der Next-Generation-Sequencing-Technologien eröffnet dem Fach Pathologie nicht nur völlig neue Möglichkeiten in Forschung und Diagnostik, sondern stellt es auch vor große Herausforderungen.
Der Nachweis zahlreicher genomischer Alterationen (Punktmutationen, kleine Insertionen und Deletionen, Fusionstranskripte, Tumormutationslast [TMB]) wird bereits zuverlässig in der molekularpathologischen Routinediagnostik eingesetzt. Diese werden in absehbarer Zeit durch zahlreiche weitere Anwendungen (Genamplifikationen, Mikrosatelliteninstabilität, genomische Signaturen wie homologe Rekombinationsdefizienz (HRD), mRNA-Profile, B‑ und T‑Zellklonalität, DNA-Methylierung) ergänzt werden.
Herausforderungen in der Präanalytik, der Beurteilung der Assaysensitivität und -spezifität sowie der Bewertung der identifizierten Aberrationen (Variantenbewertung), die die Ausbildung und den Einsatz neuer Fachkräfte erfordern, werden dargestellt und diskutiert.
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Glossar
Begriffe
Alignment
Abbildung erhaltener Sequenzen auf ein Referenzgenom (aktuell für humane Sequenzen: meist hg19), nach wie vor computertechnisch nicht 100 % fehlerfrei gelöst
BAM
„Binary alignment map“, binäres Format zur Speicherung von Sequenzdaten, komprimierte Version eines SAM-Files. SAM-Files sind wie Texte lesbar, BAM-Files nicht
BCL
„Binary base call“, enthält Daten zu jeder einzelnen identifizierten Base, muss in ein FASTQ-File umformatiert werden (sind sehr groß)
BED
„Browser extensible data“, enthält zusätzliche Informationen, z. B. Abschnitte des menschlichen Genoms in einem NGS-Panel (genomischen Koordinaten aller Amplikons)
Chip
Mikrowell-Array, in dem die IonTorrent-Sequenzierung stattfindet
FASTQ
Textbasiertes Format, vereinigt Sequenzinformation und zugehörige Qualitätsparameter
flow cell
Reaktionskammer, in der die Illumina-Sequenzierung stattfindet
vcf
„Variant call format“, enthält eine Liste der identifizierten Varianten mit statistischen Informationen
vus/uv
„Variant of unknown significance, unclassified variant“
Qualitätsparameter
Aligned Reads
Anteil der Sequenzen (in %), die korrekt zugeordnet werden konnten, abhängig von der Qualität der Sequenzen
Lesetiefe an der
Häufigkeit, mit der eine gegeben Position sequenziert wurde
Mittlere Lesetiefe
Durchschnittliche Häufigkeit, mit der alle Positionen sequenziert wurden
Phred score
Maß für die Wahrscheinlichkeit, dass die Base an einer gegebenen Position korrekt erkannt wurde. Ein Phred Score von 30 entspricht einer 99,9 %igen Wahrscheinlichkeit für die Richtigkeit der Sequenz.
Read-Ausbeute
Gesamtzahl der erhaltenen Sequenzen, abhängig von der Panelgröße (Zahl der Exons bzw. Gene) und der Zahl der parallel in einem Lauf sequenzierten Proben
Strand bias
Eine Variante findet sich überwiegend nur in einem der beiden DNA-Stränge, sollte i. d. R. nicht größer als 80:20 bzw. kleiner als 20:80 sein
VAF/MAF
„Variant allele frequency, mutant allele frequency“, Anteil der varianten Sequenz (in %) an der Zahl aller Sequenzen für diese Position
Varianten Position
Kann von der mittleren Lesetiefe erheblich abweichen
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Metadaten
Titel
Next Generation Sequencing in der Pathologie
Anwendungen und methodische Herausforderungen
verfasst von
Univ.-Prof. Dr. Ulrich Lehmann
Prof. Dr. Andreas Jung
Publikationsdatum
24.09.2021
Verlag
Springer Vienna
Erschienen in
Wiener klinisches Magazin / Ausgabe 6/2021
Print ISSN: 1869-1757
Elektronische ISSN: 1613-7817
DOI
https://doi.org/10.1007/s00740-021-00411-2

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