NGS (next generation sequencing) oder die gute alte Sanger-Sequenzierung? – Was ist zu beachten?

Die Einzelgenanalyse mittels Sanger-Sequenzierung basiert üblicherweise auf einer oder mehreren Polymerasekettenreaktionen (PCR), mit denen die Regionen (Exons, Exon‑/Intron-Übergänge) von Interesse mit spezifischen Primern amplifiziert werden. Nach Reinigung der PCR-Produkte erfolgt die Sequenzierung z. B. im Kapillarsequenzierer (in Abhängigkeit vom Gerät können Sequenzen von 300–1000 bp Länge gelesen werden), anschließend die Auswertung mit einer Analysensoftware. Die Methodik erlaubt die Detektion einzelner Nukleotidsubstitutionen (Missense‑, Nonsense‑, Splice-Site-Mutationen) und kleiner Deletions- und Insertionsdefekte, Nukleotid-Repeat-Expansionen, große Deletionen, Konversionen und Duplikationen können jedoch nicht erfasst werden. Um diese zu detektieren, wird häufig die MLPA („multiplex ligation dependent probe amplification“) verwendet, die eine von mehreren Methoden der Kopienzahlanalyse darstellt, aber durch die Wahl spezifischer Sonden zusätzlich auch bestimmte bereits bekannte Genvarianten detektieren kann [7].

Das alle Bereiche (Protein-kodierende wie auch -nichtkodierende) des Genoms erfassende WGS ist die erfolgversprechendste Methodik, um neue Gene und krankheitsrelevante Sequenzen zu identifizieren. Aufgrund der riesigen Menge untersuchter und analysierter Daten ist jedoch die Wahrscheinlichkeit für Zusatz- und unklare Befunde sehr hoch, sodass diese Methodik großteils noch in der Forschung und lediglich bei ausgewählten diagnostischen Fragestellungen zum Einsatz kommt.

Eine hohe Wahrscheinlichkeit für Zusatz- und unklare Befunde gibt es auch bei dieser Anwendung, obwohl hier lediglich die Protein-kodierenden Bereiche untersucht werden. Diese stellen zwar nur ca. 1–2 % des gesamten Genoms dar, bedeuten aber immer noch die Analyse von ca. 20.000 Genen, anhand derer ca. 85 % der Erkrankungen abgedeckt werden können. Daher stellt WES zwar eine weiter verbreitete Diagnostikanwendung dar als WGS, hat gegenüber diesem aber auch den Nachteil, dass eine Anreicherung des Exoms erfolgen muss, die bezüglich der vollständigen Abdeckung der untersuchten Bereiche oft Probleme aufwirft. Letztere Schwierigkeit gilt für alle NGS-Anwendungen, die auf die Analyse der exonischen Bereiche ausgerichtet sind.

Clinical Exome Sequencing beinhaltet eine gezielte Untersuchung des Protein-kodierenden Bereichs von Genen (ca. 5000 bis 7000), für die eine Assoziation mit einer Erkrankung als gesichert gilt. Grundlage für die Auswahl dieser Gene sind neben Leitlinien für die entsprechenden Erkrankungen auch Datenbanken wie OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man), Orphanet (Portal für seltene Krankheiten und Orphan Drugs) oder RefSeq-Projekte, z. B. MANE (Matched Annotation from the NCBI and EMBL-EBI) Plus Clinical. CES, WES und WGS werden insbesondere für Erkrankungen mit unspezifischen Symptomen genutzt und sind so differenzialdiagnostisch sehr wertvoll. Die Ausrichtung von CES auf diese krankheitsassoziierten Gene bietet gegenüber der Analyse des kompletten Exoms (WES) den Vorteil der geringeren Kosten, einer schnelleren Bearbeitungszeit und vor allem auch einer einfacheren Interpretation der Daten. Weiters steigert eine deutlich höhere Abdeckung (Coverage) der krankheitsrelevanten Gene die Wahrscheinlichkeit, die genetische Ursache einer Erkrankung nachzuweisen. Nachteil ist, dass pathogene Varianten in Genen, die bislang nicht mit Erkrankungen in Zusammenhang gebracht wurden, mittels CES nicht erfasst werden können.

Krankheitsspezifische Multi-Gen-Panels (Targeted Sequencing), bei denen der exonische Bereich einer begrenzten Auswahl von Genen, für die krankheitsverursachende Varianten bekannt sind, untersucht werden, haben den Vorteil, dass die Wahrscheinlichkeit für Zusatzbefunde und unklare Ergebnisse geringer ist als bei WGS, WES und CES. Von Nachteil hingegen ist, dass aktuelle Erkenntnisse von neuen krankheitsrelevanten Genen nicht unmittelbar in eine derartige Analyse einfließen können. Um neue Gene mit dem Panel zu analysieren, muss das Panel angepasst werden, wobei eine solche Adaptierung in der Regel nur in größeren Zeitintervallen (z. B. alle 12 Monate) erfolgt. Für differenzialdiagnostische (pathogene Varianten in anderen Genen, die zu ähnlicher klinischer Symptomatik führen) Fragestellungen ist das Gen-Panel im Vergleich zu WES und CES weniger geeignet.

Ausgehend von aus Blut oder Geweben isolierter Doppelstrang-DNA werden DNA-Fragmente erzeugt, an die spezifische Adapter-Oligonukleotide gebunden werden und die dann als „Library“ (DNA-Bibliothek) bezeichnet werden. An eine Oberfläche gebunden, werden diese Fragmente inklusive der Adaptoren mittels PCR-basierter Methoden vervielfältigt (amplifiziert), sodass Cluster mit einer hohen Dichte identischer DNA-Fragmente (massives paralleles Sequenzieren, „deep sequencing“) generiert werden, in denen die eigentliche Sequenzierung abläuft. Die erhaltenen Datenmengen müssen adäquat gespeichert und bioinformatisch aufbereitet werden (Vergleich der detektierten Sequenzen – „Reads“ – mit dem Referenzgenom), um sinnhaft weitergegeben und interpretiert werden zu können. Im Rahmen der primären Datenanalyse werden diese „Reads“ zusammengefügt und einer Referenzsequenz des humanen Genoms zugeordnet (als Alignment bezeichnet). Dann erfolgt die sekundäre Datenanalyse, mittels derer Unterschiede zwischen Referenzgenom und Patient:innenprobe („variant calling“) detektiert werden, wobei bei diesem Schritt auch Sequenzierartefakte herausgefiltert werden müssen. Die personenindividuellen Unterschiede zum Referenzgenom werden als Varianten bezeichnet, die im Rahmen der tertiären Datenanalyse mittels verschiedener Softwareprogramme und Datenbanken und in Zusammenschau mit klinischen Informationen bzw. wenn notwendig nach Rücksprache mit den Zuweiser:innen klassifiziert werden. Diese Klassifikation (C1–C5) und Interpretation („annotation“) erfolgt nach den international gültigen Kriterien von ACMG (American College of Medical Genetics and Genomics) und AMP (Association for Molecular Pathology) [9].

Für die Analyse mittels NGS kommen verschiedene Verfahren zur Anwendung, die nach den entsprechenden Anbietern als Plattformen bezeichnet werden (z. B. Illumina, etc.), wobei schlussendlich für alle Verfahren die Sequenziertiefe bzw. Coverage (Abdeckung) eines der wichtigsten Qualitätsmerkmale ist. Letztere gibt an, mit welcher Häufigkeit jedes Nukleotid im Durchschnitt erfasst wird, und stellt ein Maß für die Genauigkeit/Zuverlässigkeit dar, mit der eine Variante detektiert wird, wenn sie vorhanden ist.

Wie schon bei der Einzelgenanalyse angeführt, ist auch bei NGS-Verfahren vor der Bewertung der Analysenergebnisse auf die Limitationen der jeweiligen Anwendung zu achten. Dazu kann gehören, dass regulatorische Mutationen in intronischen Bereichen (> ± 5 bp zur Exongrenze), größere genomische Deletionen oder Duplikationen (> 50 bp), strukturelle Rearrangements (Translokationen und Inversionen) bzw. Repeat-Expansionen nicht detektiert werden. Auch die zuverlässige Analyse von Genen mit Pseudogenen bzw. homologen Regionen kann eingeschränkt sein. Hier ist, abhängig von der Fragestellung, zusätzlich eine Untersuchung der Kopienzahl („copy number variations“) nötig, z. B. MLPA (siehe oben) oder Array-CGH („array-based comparative genomic hybridization diagnostics“) zur genomweiten Deletions‑/Duplikationsanalyse.

Diese stehen, wie oben angeführt, nicht mit der ursprünglichen Fragestellung in Verbindung, können aber trotzdem für die Gesundheit bzw. Familienplanung der untersuchten Personen oder ihrer Verwandten von Bedeutung sein. Dazu gehören ein eventueller Überträgerstatus für eine rezessive Erkrankung oder bekannt pathogene Genvarianten (z. B. für Brustkrebs), die aber nicht in Zusammenhang mit der zur Analyse führenden bestehenden Symptomatik stehen. Es muss sich dabei um Varianten handeln, die klar krankheitsverursachend sind und für die präventive oder therapeutische Konsequenzen für die Untersuchten oder deren Familie bestehen. Weiters ist gefordert, dass derartige Ergebnisse auch analytisch gesichert und wissenschaftlich validiert sind. Laut der Österreichischen und der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik (ÖGH und GfH) wird für die Beratung mitteilungsrelevanter (Zusatz)befunde folgende Kategorisierung [5] nach ihrer Bedeutung für die untersuchte Person vorgeschlagen, wobei die Übergänge zwischen den Kategorien 1–3 fließend sein können:

Die mittels Sanger-Sequenzierung oder NGS detektierten Varianten sind zu klassifizieren und HGVS-konform im Befund anzugeben [9, 11]. Pathogene (C5) und wahrscheinlich pathogene (C4) Varianten werden berichtet, benigne (C1) und wahrscheinlich benigne (C2) üblicherweise nicht. Die Mehrzahl der Varianten ist zwar bekannt, da sie in der Fachliteratur in Zusammenhang mit der Erkrankung beschrieben worden bzw. in Datenbanken gelistet sind, viele können aber nicht eindeutig als pathogen oder benigne eingestuft werden und werden daher als Varianten unklarer Signifikanz (VUS, C3) klassifiziert. Ob C3-Varianten im Befund ausgewiesen werden oder wie C1- und C2-Varianten auf Anfrage erhältlich sind, sollte im Befund dargelegt sein. Funktionelle Untersuchungen, Überprüfung der Häufigkeit dieser Varianten in einer Kontrollpopulation oder weitere Untersuchungen im Tumormaterial bzw. Kosegregationsanalysen in betroffenen versus nicht betroffenen Familienmitgliedern könnten helfen bzw. wären notwendig, um eine VUS (C3) doch noch in Varianten der Klassen 1, 2, 4 oder 5 einstufen zu können. Diese Untersuchungen sind aufgrund des zeitlichen, wie auch personellen und finanziellen Aufwands kurzfristig oft nicht möglich. Manchmal ist es auch sinnvoll, seitens des Diagnostikanbieters den Zuweiser zu kontaktieren, um der Klassifikation dienliche klinische Information einfließen lassen zu können. Sind VUS im Befund dokumentiert, können diese auf Anfrage des Zuweisers zu einem späteren Zeitpunkt seitens des Diagnostikanbieters nach dem dann aktuellen Stand der Wissenschaft reevaluiert werden, sodass sich für manche VUS zu einem späteren Zeitpunkt eine geänderte Klassifikation in Richtung benigne oder pathogen ergeben könnte.

Grundlage der genetischen Untersuchungen in Österreich ist das Gentechnikgesetz (GTG), ein aus 1994 stammendes Bundesgesetz, mit dem Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen, das Freisetzen und Inverkehrbringen von gentechnisch veränderten Organismen und die Anwendung von Genanalyse und Gentherapie am Menschen geregelt werden. Befundung und Beratung haben weiters unter Wahrung des größten Nutzens und des geringsten Risikos für Ratsuchende, Patient:innen und deren Familien zu erfolgen.